Mikroskopy świetlne (optyczne) wykorzystują światło w zakresie fal widzialnych i umożliwiają obserwacje powierzchni obiektów w rozdzielczości, która nie jest osiągalna dla ludzkiego „gołego oka”. Powiększenie mikroskopu, czyli stosunek rozmiaru uzyskanego obrazu do rozmiaru oglądanego obiektu, zależy od iloczynu:

• powiększenia obiektywu,
• powiększenia okularu,
• powiększenia nasadki okularowej.

   Zastosowanie światła widzialnego pozwala na maksymalnie na powiększenie obiektu około 1500 razy. Mikroskopy optyczne osiągające najwyższe powiększenia, działają w oparciu o wykorzystanie dodatkowo spolaryzowanego promieniowania ultrafioletowego. Mogą osiągać powiększenia aż do około 3500 razy.

   Oprócz powiększenia bardzo istotnym parametrem mikroskopu, świadczącym o jego jakości, jest zdolność rozdzielcza obiektywu. Jest to najmniejsza odległość pomiędzy dwoma punktami na powierzchni obserwowanego obiektu, które mogą być rozpoznawane przez obserwatora jako osobne elementy.

 

Mikroskop fluorescencyjny – mikroskop świetlny wykorzystujący zjawisko fluorescencji.
Pozwala osiągnąć rozdzielczość rzędu 0,2µm. 

• Fluorescencja to własność niektórych substancji chemicznych polegająca na emitowaniu światła widzialnego pod wpływem naświetlania promieniami ultrafioletowymi. 
  
  
• Fluorochromy to barwniki fluorescencyjne. Mają zdolność do absorbowania światła o określonej długości fali i emitowania promieniowania o innej długości fali. Używane są do znakowania (barwienia) interesujących nas molekuł w utrwalonych i żywych komórkach. 

 

Rys. 1. Mikroskop fluorescencyjny – zasada działania:

 

• Próbka jest oświetlana przez źródło światła w całości. 
• Filtr wzbudzenia pozwala na uzyskanie światła UV o określonej długości fali. 
• Przefiltrowane światło UV wzbudza preparat.
• Preparat emituje fluorescencję.
• Wyemitowane światło przechodzi przez filtr barierowy (przepuszcza tylko światło widzialne). 
• Obiektyw zbiera sygnał nie tylko z miejsca ogniskowania, ale z całego przekroju próbki. 
• Mikroskop konfokalny zasada działania 
• Obiektyw zbiera sygnał tylko z miejsca ogniskowania (płaszczyzny formowania obrazu ), dzięki obecności specjalnej przesłony z otworem

 Obraz 3D – zestawienie obrazów z jego różnych warstw. 

Rys. 2. Mikroskop konfokalny- zasada działania jest podobna do opisanej dla mikroskopu fluorescencyjnego z różnicą: 

• Obiektyw zbiera sygnał tylko z miejsca ogniskowania (płaszczyzny formowania obrazu ), dzięki obecności specjalnej przesłony z otworem
•  Obraz 3D – zestawienie obrazów z jego różnych warstw. 

 

 

Rys. 3. Mikroskop fluorescencyjny i konfokalny – porównanie

Porównanie obrazów uzyskanych za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (po lewej)  i konfokalnego (po prawej) fragment jajnika mrówkolwa. Czerwony – aktyna filamentarna, białko.

Ryc. 4. Jak powstaje obraz 3D?

Po zeskanowaniu obiektu w kilku płaszczyznach nakłada się uzyskane obrazy i otrzymuje się rekonstrukcję trójwymiarową. 

 

Ryc. 5. Alfa- aktynina w mięśniach szkieletowych Danio rerio

Za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu konfokalnego wykonano szereg zdjęć obiektu, w kilku kolejnych płaszczyznach. Poszczególne przekroje posłużą do rekonstrukcji trójwymiarowej (Olympus FV1000). Fot. Magda Dubińska-Magiera

 

Ryc. 6. Alfa- aktynina w mięśniach szkieletowych Danio rerio – rekonstrukcja trójwymiarowa

Nałożenie zdjęć wykonanych w różnych płaszczyznach przekroju obiektu umożliwiają rekonstrukcję trójwymiarową preparatu (Imaris, bitplane). Fot. Magda Dubińska-Magiera

Mikroskopia jest szeroko wykorzystywana w badaniach naukowych i medycznych. Mikroskopów używa się do obserwacji żywych organizmów na różnych poziomach organizacji ich struktur. Analizuje się zarówno organy i tkanki, jak i identyfikuje elementy składowe na poziomie molekularnym. 

Mikroskopia jest ważną techniką badawczą także w biologii rozwoju zwierząt: 

• Mikroskop świetlny może być przykładowo używany do przyżyciowe obserwacji rozwoju ryby danio pręgowanego (Danio rerio). Danio pręgowane unieruchamia się w specjalnym medium, które pozwala na przyżyciową obserwację kolejnych stadiów rozwojowych (Kaufmann i wsp. 2012). 
• Przykładem zastosowania mikroskopii fluorescencyjnej są m.in. badania rozwoju miotomalnego mięśni różnych gatunków zwierząt, m. in. takich jak jaszczurka zwinka (Rupik i wsp. 2012).

Prowadzenie badań w niektórych dziedzinach nauk biomedycznych jest znacząco ułatwione dzięki specjalnym „narzędziom badawczym” – zwierzęta modelowe posiadające np. znakowane fluorescencyjnie tkanki czy organy. Takie organizmy upraszczają badania prowadzone za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. 

Powszechnie stosowanym organizmem modelowym jest danio pręgowane. Ryba ta jest wykorzystywana m. in. w badaniach zaburzeń funkcjonowania mięśni (Plantie i wsp. 2015). Zastosowanie linii Danio rerio, charakteryzującej się znakowanymi fluorescencyjnie nerwami pozwoliło m. in. na analizę mechanizmu regeneracji nerwu oka (Diekmann i wsp. 2015). 

Podstawowe zasady mikroskopowania przedstawiono w filmie Mikroskopowanie: do obejrzenia TUTAJ

 

Literatura:

Kaufmann A, Mickoleit M, Weber M, Huisken J (2012) Development. 139(17):3242-7. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. doi: 10.1242/dev.082586.

 

Diekmann H, Kalbhen P, Fischer D (2015) Characterization of optic nerve regeneration using transgenic zebrafish. Front Cell Neurosci. 9:118. doi: 10.3389/fncel.2015.00118. eCollection 2015.

 

Rupik W, Swadźba E, Dubińska-Magiera M, Jędrzejowska I, Daczewska M (2012) Reptilian myotomal myogenesis-lessons from the sand lizard Lacerta agilis L. (Reptilia, Lacertidae) Update. Zoology (Jena). 115(5):330-8. doi: 10.1016/j.zool.2012.04.002. Epub 2012 Aug 18.

 

Plantié E, Migocka-Patrzałek M, Daczewska M, Jagla K (2015) Model Organisms in the Fight against Muscular Dystrophy: Lessons from Drosophila and Zebrafish. Molecules. 2015 Apr 9;20(4):6237-6253.

 

Litwin JA, Gajda M (2011) Podstawy technik mikroskopowych. Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego